流加培養

流加培養（りゅうかばいよう、フェッドバッチ、fed-batch culture）は、微生物や動物細胞の工業的な液体培養法のひとつである。半回分培養（はんかいぶんばいよう、semi-batch culture）ともいう。 すなわち、流加培養とは、微生物あるいは動物細胞を工業的に液体培養する際に、ある特定の物質（多くの場合、培地成分。1成分あるいは複数の成分あるいは総ての培地成分でもよい。さらに、目的代謝産物の前駆体でもよい。）をバイオリアクター（培養槽）へ外部から供給するが、培養ブロス（細胞と培養液を合わせたもの）は収穫前の途中には抜き取らないような培養法である。この培養技術について、まず概要および利点を述べ、歴史を振り返って、次に通常の回分培養と比較して流加培養が有利となる7つの場合を説明する。次に、流加培養をフィードバック制御の有り、無しの2方式に大分類し、それぞれの方式を更にいくつかに細分類して、数式を交えて詳しく説明する。最後に、流加培養のスタートアップとスケールアップについて述べる。

概要

流加培養とは、微生物または動物や植物の細胞を工業的なバイオリアクター（培養槽）で液体培養する際に、培養中ある特定の基質（栄養源、培地成分）をバイオリアクターへ供給するが、培養ブロス（菌体、細胞と培養液）は収穫時までバイオリアクターから抜きとらないような培養法であるTsuneo Yamanè, Shoichi Shimizu (1984) “Fed-batch Techniques in Microbial Processes” Advances in Biochem Eng/Biotechnol, 30:147-194.山根恒夫 (1987)「半回分発酵の速度論」発酵工学会誌、56(6), 310-322。山根恒夫、中野秀雄、加藤雅士、岩崎雄吾、河原崎泰昌、志水元亨 (2016)『新版生物反応工学』 第２章　微生物・動物細胞の培養工学、2.4 微生物の培養法とその操作法、産業図書（株）、東京、56-63.。流加基質としては、1成分または2成分以上でもよい。出典は1984年に発表された総説であり、出典は2013年に出版された単行本でありHenry C. Lim and Hwa Sung Shin (2013) "Fed-Batch Cultures: Principles and Applications of Semi-Batch Bioreactors", Cambridge University Press, 32 Avenue of the Americas, New York, NY 10013-2473, USA.、それぞれの発行年までの流加培養に関連する諸論文がほぼ網羅されている。 この特性から考えると、本質的には回分培養（かいぶんばいよう）（バッチ培養, batch culture）であり、その1つの変形とみなされよう。英語ではfed-batch cultureまたはsemi-batch cultureと呼ばれ, extended cultureV. H. Edwards, M. J. Gottschalk, A. Y. Noojin, 111, L. B. Tuthill, and A. L. Tannahill (1970) "Extended Culture: The Growth of Candida Utilis at Controlled Acetate Concentrations" Biotechnol. Bioeng., 12(6), 975-999. という言葉も以前は用いられた。ドイツ語では, Zulaufsverfahren と呼ばれている。これらの呼称のうち, 半回分（はんかいぶん）semi-batchという言葉は、反応工学では既に確立した用語となっているが、微生物反応の半回分操作においては、供給される基質は微生物に摂取される栄養物質である場合が多いので, fed-batchという言葉が一番適切であろう。事実、多くの英文の報文や総説でこの専門用語が用いられている。今日では、微生物や細胞の培養工学では、回分培養、流加培養、連続培養 (batch, fed-batch, and continuous cultures) が3点セットで記述されている。

サムネイル|流加培養（フィードバック制御のある場合）センサーは1つだけとは限らないで、複数のセンサーからの情報をコンピュータに入力することもある。 流加培養において、どのような物質を流加基質とし、どのように流加するかは、企業のノウハウに属する極秘技術であり、工業的流加培養の詳細を知ることは困難であるが、相当数の工業的発酵がこの方法で行われている。 流加培養の利点は、培養液中の流加基質濃度を任意に制御できることである。すなわち、回分培養では、必要な培地成分はすべて、一度に前もって加えられ、それらの濃度はまったく制御されないで微生物まかせである。これに対して流加培養では流加基質（類）は目的に応じて少しずつ供給されるので、培養液中のそれらの濃度を最適に制御できる（ほとんどの場合、低濃度に制御される）。一方、連続培養（ケモスタット）では、増殖制限基質も含めてすべての培地成分が一定の値に維持される。したがって、微生物の置かれている環境制御という視点からすると、流加培養は回分培養と連続培養との中間に位置する培養であると言えよう。現在、雑菌汚染、ファージ汚染、あるいは突然変異などの問題により、工業的な連続培養は、いくつかの限られた発酵以外は実施されていない。ゆえに、回分培養の改良という観点から流加培養はますます重視される。

歴史

"fed-batch"という英語の専門用語は1973年に発表されたオリジナルな学術論文のタイトルに歴史上初めて現れているFumitake Yoshida, Tsuneo Yamane and Ken-ichiro Nakamoto (1973) "Fed-batch hydrocarbon fermentation with colloidal emulsion feed" Biotechnology and Bioengineering, 15(2), 257-270..　出典は微生物と細胞の培養全般に関する単行本であるが、第21章に流加培養が記述されているS. John Pirt (1975) "Principles of Microbe and Cell Cultivation" Blackwell Scientific Publications, Chapter 21, 211-218.。しかし、議論は定流量流加法（後述）に限定されており、また、流加液中の基質濃度は回分培養における初発基質濃度と等しく、流加培養中のバイオリアクター内の培養液の増加が著しく、工業的流加培養の議論とは言い難い。しかし、実社会ではこれより遙か以前から、実施されていた。すなわち、この発酵プロセスないし操作法で、一番古くまた一番よく知られている例は、パン酵母製造において副産物であるアルコールの生成をできるだけ抑え、それだけ酵母菌体の対糖収率を高めるために、低糖濃度を維持するように糖を間欠的に逐次添加する方法である（ドイツの特許が、1917年に出願され、第1次世界大戦直後、1919年に公開されている）Friedrich Hayduck (1919) "Verfahren der Hefefabrikation ohne order mit nur geringer Alkoholerzeugung", DE 300662.。更にこの方法を改良したパン酵母の流加培養法の特許が1933年に受理されているWestfälische Hefefabrik G.m.b.H.,(1933)"Verfahren zur Herstellung von Hefe nach dem Zulaufverfahren", DE 583760 C.。流加法によるパン酵母の製造は、その後いろいろ改良が加えられておりHenry Y. Wang, Dr. Charles L. Cooney, Daniel I. C. Wang (1979) "Computer control of bakers' yeast production" Biotechnol. Bioeng., 21(6), 975-995.、工業的に重要な流加発酵プロセスである。 歴史上、次いで現われたのは、ペニシリン発酵において、エネルギー源（たとえば、グルコースなど）とペニシリンの前駆体（たとえばフェニル酢酸）とを逐次添加する方法であるMarvin J. Johnson (1952) "Recent advances in penicillin fermentation", Bull. World Helth Org., 6:99-121.。 次に、1956年グルタミン酸発酵から始まった、日本が世界に誇るアミノ酸発酵において、いくつかのアミノ酸発酵に流加法が用いられた(一例は出典)。 さらに、遺伝子工学の発展後、組換え体（主として大腸菌の組換え体）の高密度培養に流加法が採択された。組換え酵母による異種タンパク質生産にも適用されているO Mendoza-Vega, J. Sabatie, S. W. Brown (1994) "Industrial-Production of Heterologous Proteins by Fed-Batch Cultures of the Yeast Saccharomyces-cerevisiae" FEMS Microbiology Reviews, 15:369-410.。 最近では、動物細胞（主としてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞）の高密度液体培養による抗体医薬製造に適用されているZhou Jiang, Kurt Droms, Zhaohui Geng, Susan Casnocha, Zhihua Xiao, Steve Gorfien and Scott J. Jacobia (2012) "Fed-Batch Cell Culture, Process Optimization--A Rationally Integrated Approach--" BioProcess International,10(3), 40-45.Wen‑Jing Xu, Yan Lin, Chun‑Liu Mi, Jing‑Ying Pang, Tian‑Yun Wang (2023) "Progress in fed‑batch culture for recombinant protein production in CHO cells" Applied Microbiology and Biotechnology, 107, 1063-1075.。

流加培養が有利な場合 一般的に言って、ある培地成分の濃度の大小が生産性や収量に著しく影響されるような場合には流加発酵が従来の回分発酵より有利である。そのような場合としては、次の7つの場合が挙げられる。

高密度培養（高細胞濃度培養）

1L当たり50〜150 g乾燥菌体程度の高菌体濃度（高密度）を達成しようとする時、それに必要な栄養素を一度に仕込めば高濃度となり、たとえ通常は基質阻害を起こさないと考えられているような基質でも浸透圧効果と高濃度阻害のため、菌は増殖しない。よって、ほとんど総ての栄養源を過不足なく流加し続ける以外に方策はない。組換え大腸菌の高密度培養については、多くの研究がなされたDieter Riesenberg (1991) ”High-cell-density cultivation of Escherichia coli ” Curr Opin Biotechnol, 2, 380-384.L. Yee, Harvey W. Blanch (1992) “Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli”. Bio/Technology (N Y), 10,1550-1556.Sang Yup Lee (1996) "High cell-density culture of Escherichia coli" Trends Biotechnol., 14:98-105.Joseph Shiloach, Rephael Fass (2005) "Growing E. coli to high cell density--a historical perspective on method development" Biotechnol Adv 2005, 23:345-357.。Kishimoto等は、大腸菌でよく使用されるＬＢ培地（実際はmodified LB medium)の元素分析と乾燥菌体の元素分析を比較して不足する成分を補うような流加液の組成を決定して、エキスパートシステムを適用して、E. coli W3110株を、24時間で125g乾燥菌体/Lという高密度培養に成功しているMichimasa Kishimoto and Hideyuki Suzuki (1995) "Application of an Expert System to High Cell Density Cultivation of Escherichia coli", J. Ferment. Bioeng., 80, 58-62.。動物細胞の培養には複雑で高価な培地が必要であるが、培地組成のなかで炭素源としてグルコースおよび窒素源としてグルタミンがよく使われる。その高密度培養（1×107 cells/mL以上）のために回分培養を行うと、乳酸やアンモニアなどの有害物質が過剰に蓄積し、これらが細胞増殖を阻害する。培地を流加すれば、それらの阻害を防止でき、さらに培地成分をきわめて有効に使い尽くすことができる。

高濃度基質阻害のある場合

メタノール、エタノール、酢酸、芳香族化合物など、比較的低い濃度でも増殖阻害を起こす基質の場合は、基質を流加することにより、誘導期の短縮と増殖阻害の軽減が期待できる。

クラブトリー効果の存在する場合

クラブトリー効果 (Krabtree effect) とは、酵母（主としてパン酵母）の培養において、糖濃度が高くなりすぎると、たとえ溶存酸素（DO）が十分存在していても、糖からエチルアルコール（および少量のグリセリンと酢酸）が生成し、それだけ菌体の対糖収率が低下する現象である。グルコース効果 (glucose effect) とも呼ばれる。大腸菌や枯草菌などの細菌の好気培養においても、糖濃度が高いと、酢酸、乳酸、蟻酸などの有機酸が副生し、増殖阻害を起こしたり代謝活性に悪影響を与える。これを細菌クラブトリー効果 (bacterial Krabtree effect) と呼ぶ。 ゆえに、酵母の対糖収率低下をきたさない程度に糖濃度を低く抑える必要があり、そのためパン酵母生産では流加培養法が常用されている。また、遺伝子組換え大腸菌も酢酸などの有機酸の生成を抑えるために、流加培養法が適用されている。

異化物抑制を受ける場合

グルコースのように容易に資化される炭素源で微生物を回分的に増殖させると、ある種の酵素、とくに異化代謝に関係する酵素（群）の生合成は抑制させる。この効果は異化物抑制 (catabolite repression) と呼ばれる。そのような酵素生合成の抑制効果に打ち勝つ1つの強力な手段が流加法であり、これによって、糖濃度を低下させ、増殖を抑え、酵素生成は脱抑制される。また、ペニシリンなどの抗生物質の生合成代謝にも異化物抑制効果がみられ、流加法は収量の向上をもたらす。

栄養要求変異株を用いる発酵

栄養要求変異株 (auxotroph mutant) を用いる発酵では、要求される物質を過剰に加えると菌体増殖のみか起こって、目的代謝産物の生成は少ない。一方、非常に不足の場合も菌体増殖は抑えられ、その微生物による代謝産物の生成は少ない。したがって、その中間に最適濃度があるはずであり、それを達成するために流加発酵が実施されている。例えば、L-グルタミン酸発酵に用いられるコリネ菌 (Corynebacterium glutamicum) のホモセリン要求株をL-ホモセリン、あるいはL-スレオニンとL-メチオニンを制限して培養する（栄養要求物質を生育に必用な量よりも少なく与えて培養する）ことにより、著量のL-リジンが培地中に蓄積する。絶えず制限して培養するために、栄養要求物質は流加される（一例は出典）。

抑制性プロモーターを持つ遺伝子の発現制御

組替え微生物による異種タンパク質生産に影響する因子は多数存在するが、遺伝子の分子構造上の因子のうち、特に重要なのはプロモーターの種類と強さである。プロモーターはその発現様式から、構成的 (constitutive) なものと調節性 (regulable) なものに大別され、後者はさらに誘導性 (inducible) なものと抑制性 (repressible) なものとに細分される。抑制性プロモーターでは、培地中にある化合物が存在すると、その化合物（もしくはその代謝産物）がコリプレッサーとしてアポリプレッサーと結合しホロレプレッサーとなり、これが遺伝子上流のオペレーターに結合して転写ができなくなる。しかし、通常その化合物は菌の増殖には必須である。よって、遺伝子発現に好適な非常に低い濃度に保ちつつ培養する。そのため、その化合物は流加される。trp operon（トリプトファン　オペロン）やphoA（アルカリホスファターゼをコードする遺伝子）などがその例であるNeubauer P and Winter J (2003) "Expression and fermentation strategies for recombinant protein production in Escherichia coli". In: Merten OW et al. (Eds). Recombinant Protein Production with prokaryotic and eukaryotic cells. A comparative view on host physiology. 2001, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands. Therapeutic proteins from the inclusion bodies of Escherichia coli. Adv Biochem Eng/Biotechnol 2003, 85:43-93.。

反応時間の延長、水分損失の補填、培養液粘度の低下

目的代謝産物の生成が指数期から減速期にかけて顕著である場合、この期間を引き延ばし1回当たりの生産量を増大させることが可能である。長時間、好気培養を続けると、排気ガスによって、培養液量が減少することがある。また、目的代謝産物が多糖類などの場合は、培養液の粘度が異常に高くなって、発酵の続行が難しいこともある。これらの問題を解決するために、時として、流加法が適用される。 流加培養で基質濃度を任意に制御できることの証明 前述の概要で、流加培養の利点は培養液中の流加基質濃度を任意に制御できること、と述べた。このことを簡単な数式で以下に示す。今、ただ1種類の基質Ｓを流加し、ある微生物を好気培養して、二酸化炭素のみが生成物であるという最も単純な流加培養を考える。培養液量はほぼ変わらないと仮定すると、ある時間 t におけるＳの微分物質収支式は、

ただし、s は培養液中の流加基質濃度[g/L]、t は培養時間[h]、fvol は流加液の体積流量[L/h]、sin は流加液中の流加基質濃度[g/L]、v はバイオリアクター内の培養液量[L]、μ は微生物の比増殖速度[h-1]、Yx/s は菌体収率[g-DCW/g-substrate]、x は菌体濃度[g-DCW/L]である。右辺第1項は単位培養液当たりのＳの流加流量、第2項は x から見たＳの消費速度である。 もし、f が高くて右辺第1項＞右辺第2項ならば、ds/dt > 0 となり s は増加し、逆に f が低くて第1項＜第2項ならば、ds/dt < 0 となり s は減少する。そして、f が適切で丁度、第1項＝第2項であれば、ds/dt = 0 となり s は変わらない（一定である)。よって、f を人間の手で、あるいは自動的に、変動させることによって、s を人為的に任意に変えることができるのである。 なお、流量(flow rate)とは単位時間当たりの流体の移動量であり、国際単位系では体積流量[m3/s]（上式では、国際単位系でなく、[L/h]としている）、質量流量[kg/s]、モル流量[mol/s]があり、流速(flow velocity)とは区別されねばならない。流速とは、文字通り、流体の流れの速度（速さ）であり、単位は例えば[m/h]である（国際単位系では[m/s]）。

各種流加方式

流加培養では、基質（溶液）の流加によって、バイオリアクター内の培養液量は多かれ少なかれ、増大する。増加量が無視できる場合と、無視できない場合に大別される。前者を培養液量一定流加培養 (constant-volume fed-batch culture)、後者を培養液量可変流加培養 (variable-volume fed-batch culture) と区別できる。前者は液状基質（メタノール、エタノール、グリセリンなど）や粉末状のグルコースや濃厚基質溶液を流加する場合であり、後者はそうでない場合である。基質の水溶液をフィードする場合は、基質と共に水がフィードされるが、実用的な観点からすると、水を供給しても培養液が希釈され培養液量が増えるだけで、何のメリットもない。運転・解析の容易さを考えると、出来るだけ濃厚な溶液をフィードすべきである。 さて、流加培養の要点は、流加基質濃度を制御することであるから、その中心的問題は、何を流加するかということと、いかに流加するかということである。後者には、いつ流加を開始するかという問題も含まれる。前者を決定するには、微生物生理学、微生物遺伝学、生物化学、分子生物学などのバイオサイエンスの知識が必要である。エンジニアリングは後者とかかわりがある。流加の仕方により流加培養を分類できる。表に各種流加方式として、その分類を示す。 なお、流加培養で収穫時に培養液を一部残し、同じバイオリアクター内で次の流加培養の種菌として使い、これを繰り返すような操作法は反復流加培養（Repeated fed-batch culture (fermentation)）と呼ばれる。

+ 表　流加培養法の分類（出典に一部追加） 大分類 細分類1 細分類2 （1）フィードバック制御のない流加培養 (2)　フィードバック制御のある流加培養 表の（2）フィードバック制御のある流加培養では、大別して(2.1) 直接的と(2.2) 間接的に分類されるが、それぞれが(2.a)-(2.d)に細分類されるので、合計2×4=8通りありうることになる。

定流量流加培養

定流量流加培養 (Constant fed-batch culture, CFBC) は基質の質量流量、 [単位はg/h]、あるいは体積流量、 [単位はL/h]、が一定の場合で、最も簡単な流加培養である。流加液中の基質濃度を [単位はg/L]とすると、である。山根と平野は、この流加方式の数学的解析を行いTsuneo Yamane and Shigeki Hirano (1977) "Semi-batch Culture of Microorganisms with Constant Feed of Substrate - A Mathematical Simulation" J Fermet Technol, 55:156-165.、さらにグリセロールを流加基質として細菌Erobacter erogenesの定流量流加培養を実施して、実験的検証をおこなったTsuneo Yamane and Shigeki Hirano (1977) "Semi-batch Culture of Microorganisms with Constant Feed of Substrate-An Experimental Study" J Ferment Technol, 55:380-387.。グリセロールを流加基質とすることにより、流加基質のみ（流加水無し）の場合や流加基質の様々な濃度の水溶液の場合を実験することができて、培養液の希釈の要因としての流加水の影響を調べることができている。 この流加方式の最大の特色は、直線増殖 (linear growth) が起こることである（右図参照）。 すなわち、菌体濃度を [単位はg乾燥菌体/L]、培養時間を [単位はh]、流加開始時の培養液量を [単位はL]とすると、培養液量一定の流加培養の場合は、

(=一定)

上式は、菌体収率、 が一定ならば、直線増殖期の増殖曲線の傾きは、質量流量、、に比例することを示す。

また、培養液量を v [単位はL] とすると、培養液量可変流加培養の場合は、

（=一定）

しかし、初期条件（流加開始時の流加基質濃度、s0）によっては、その前に指数増殖期（対数増殖期）が現われる。また、直線増殖が観察されるには、流量の値に条件 (の範囲）があり、非常に低いと増殖はないし、高すぎると直線増殖は観察されない。指数増殖から、直線増殖への移行はきわめて急激であり、直線増殖期では比増殖速度 μ [単位は1/h] はずっと低くなり、時間的にあまり変化しない。菌体濃度の変化は、初期条件と希釈の程度によっていろいろな場合があり、減少することもある。また、ある特定の条件の時は、菌体濃度が時間的に変化せず一定となる。このように、定流量流加培養において菌体濃度が時間的に変化しない状態は‘準定常状態'と名付けられた。しかし、菌体濃度が時間的に変化するかどうかは、微生物の増殖の程度と流加液中の水による培養液の希釈の程度の大小によって決まるので、微生物の置かれている環境の状態からすると、直線増殖期では、非定常状態にあると言える。基質濃度 s [単位はg/L] は指数増殖から直線増殖へ移行する時点できわめて急激に（数百分の一に）減少し、直線増殖期においては、基質濃度sは基質飽和定数 Ks [単位はg/L] より低いところでゆるやかに減少しその値はKsによらない。

指数的流加法

微生物の増殖は理想的には時間に関して指数関数的であり、ケモスタッドでは流量によって希釈率を制御し、比増殖速度 μ [単位は1/h] を一定に保っている。よって、流加操作によっても μ を一定に保つように基質濃度、s を制御できるはずである。 流量を培養時間に関して指数関数的に増加させることになるので、山根らはこのタイプの流加操作を指数的流加法 (Exponential fed-batch culture, EFBC) と名付け、この流加方式に関する数学的解析および実験的研究を初めて発表したTsuneo Yamane, Michimasa Kishimoto, Fumitake Yoshida (1974) "Semi-batch Culture of Methanol-assimilating Bacteria with Exponentially Increased Methanol Feed" J Ferment Technol, 54:229-240.。 ここで、流加液の体積流量を [単位はL/h]、流加液の中の基質濃度を [単位はg/L]、培養液中の流加基質濃度を [単位はg/L]、菌体収率を [単位はg乾燥菌体/g基質]、最大比増殖速度をμmax [単位は1/h]、指数関数的に増加させる際の指数を [単位は1/h] 、培養時間を [単位はh]、とすると、一般に、 であるから、

とすれば、

(i) (一定)、

(ii) 微生物の比増殖速度μ = （一定）となり、

μ は ≤ μmax の範囲で外部から任意に制御できる、